Die hochaufragende spätgotische Stiftskirche, als evangelische Stadtpfarrkirche und hochbedeutende dynastische Grablege tagsüber für Andacht und Besuch geöffnet, steht wohl auf romanischen Gründungen: Erstnennung 1264, 1295 Ablaßurkunde für eine Wertheimer Marienkirche; über dem Nordostportal Wappenstein zum Neubau 1384; Stift seit 1481. (Für ausführliche Details – samt vollen Grafentiteln – sei auf den reich bebilderten Kirchenführer verwiesen.)
Seit 1419 hielt ein Chorherrenkapitel zu St. Marien tägliches Stundengebet und Totenmessen. Nach 1547 diente ihr Vermögen jedoch karitativen, Schul- und Pfarreizwecken. Der Chor entstand ab 1388 laut Inschrift am Anbau links (1445), für dessen Obergeschoß mit flachem Sterngewölbe der Gelehrte Konrad Wellin 1448 als Grundstock der Bibliothek 63 Bücher stiftete. Im Süden die Sakristei mit Oberkapelle, vor 1427. Am Seitenschiff eine Sonnenuhr. – Die einfache Pfeilerbasilika selbst (ca. 46 mx 21 m; H. 18 m) ziert eine elegante Portalvorhalle (15. Jahrhundert) über dem Zugang vom Markt her. Ihr Maßwerk spielt formvollendet zusammen mit dem prachtvollen „Chörle“ daneben am Turm, fast nur aus Fenstern, Fialen und Grotesken bestehend: 1419 gestiftet durch Heinrich von Mömlingen (+1430).
An der „Wertheimer Madonna“ um 1325 – innen am Aufgang zur Heilig-Geist-Kapelle (ursprünglich außen über dem Wappenstein von 1384, jetzt mit Replik) – zeigt sich der Wandel des majestätischen mittelalterlichen Marienbildes zur liebenden Mutter. Der Andachtsraum enthält noch Altarmensa und Fresken der „Drei heiligen Madel“ aus der Bauzeit. – Nördlich der Kirche der starke Turm mit Maßwerkbrüstung (frühes 15. Jahrhundert, Höhe mit Helm ca. 51 m, das Uhrwerk von 1544 heute in der Kilianskapelle). Beim Eintritt in das flachgedeckte Kircheninnere mit neugotischen Emporen und Kanzel (1846/47) erstaunt die einzigartige Häufung von Kunstwerken; gerade im Chor gibt es zu den Grabplatten oft noch ehrende „Denkmäler“.
Zuvor soll noch die Orgel von 1982 (Fa. Rensch, Lauffen) erwähnt werden, der frühbarocke Taufstein (s. Rittergasse S. 30) und der beeindruckende Kruzifixus von 1682 im Chorbogen über dem modernen Altartisch. Bei der umfassenden Renovierung von 2005 bis 2007 wurden im nördlichen Seitenschiff spätgotische Fresken gefunden und im Chorgewölbe die Rankenmalerei von 1880/90 rekonstruiert.