Die Romanische Basilika stammt aus dem 11. Jahrhundert, der Chor und der schmuckvoller Turm aus dem 13. Jahrhundert. Die mächtige Kuppel und die aufwändige Barockfassade entstanden in den Jahren 1710 bis 1716. Die barocke Neugestaltung des Innenraums zog sich bis 1788 hin und wurde von den Gebrüdern Zimmermann ausgeführt. Ein frühes Steinwerk Tilman Riemenschneiders, eine schöne Sandsteinmadonna, steht in einer Pfeilernische des Kuppelraumes. Beim Luftangriff auf Würzburg am 16. März 1945 blieb die bauliche Substanz erhalten. Die Inneneinrichtung verbrannte größtenteils, doch sind noch einige hervorragende Einzelwerke sowohl aus dem Mittelalter als auch aus der Barockzeit vorhanden.
Nach umfangreichen Renovierungsarbeiten wurde die Würzburger Neumünsterkirche am 24. Juni 2009, dem Hochfest des heiligen Johannes, wieder geöffnet. Die Neumünsterkirche gilt als Urstätte des Christentums in Franken, als ehrwürdigste Stätte des Frankenlands. Sie wurde an jener Stelle errichtet, wo 689 die Frankenapostel Kilian, Kolonat und Totnan um ihres Glaubens willen getötet und ihre Gebeine zunächst heimlich verscharrt wurden. Hier befindet sich auch das Grab des seligen Märtyrerpriesters Georg Häfner (1900-1942).